دانلود پایان نامه

دورگهسازی با توالی DNAی هدف مکمل موجود در محلول
3) بررسی الکتروشیمیایی سطح با استفاده از نشانگر یا بدون استفاده از آن
بهینه کردن هر مرحله برای بهتر کردن کارایی کلی حسگر ضروری است.

2-6- ساختار مولکول DNA [91-87]
با استفاده از مطالعات انجام گرفته تا سال ۱۹۳۰، مشخص شد که نوکلئین35، در واقع دزوکسی ریبونوکلئیک اسید (DNA) است. مولکولهای درشت حیاتی، ترکیبات بزرگی با پیچیدگی مختلفی هستند که از آن جمله، میتوان به نوکلئیک اسیدها و پروتئینها اشاره نمود. در واقع، چیزی که مرکز کنترل فرآیند سلولی است، هسته سلول میباشد. ساختاری که در هسته، این وظیفه را به عهده دارد، کروموزومها هستند. در واقع، کروموزومها ساختارهایی در هسته هستند که رهبری هسته را بر عهده دارند. قسمتهای کوچکی از کروموزومها را که فعالیت سلولی و انتقال وراثتی را بر عهده دارند، ژنها هستند که اطلاعات وراثتی را منتقل میکنند و در نهایت آنچه ژن و کروموزوم را تشکیل میدهد، ساختارهای DNA هستند.DNA ، پلیمر خطی از دزوکسی ریبونوکلئوتیدها هستند که پلی نوکلئوتید نامیده میشود. مولکول DNA، یک پلیمر خطی و بدون شاخه است که زیر واحدهای مونومری آن، چهار نوع نوکلئوتید مختلف هستند که به هم متصل شده
اند. در طول یک مولکول DNA، صدها، هزاران و حتی میلیونها واحد از این مونومرها وجود دارند. بررسی
های شیمیایی آن مشخص کرد که زیر واحد تکرار شونده اصلیDNA ، نوکلئوتید می‌باشد که از سه قسمت: یک قند پنجتایی (دزوکسی-D – ریبوز) ، یک گروه فسفات و یکی از چهار باز آلی نیتروژن‌دار حلقوی: آدنین36(A)، گوانین37(G)، سیتوزین38 (‍C) و تیمین39 (T) تشکیل شده است. از این چهار باز، دو باز دو حلقه‌ای آدنین و گوانین از بازهای پورینی40 و دو باز تکحلقه‌ای سیتوزین و تیمین از بازهای پیریمیدینی41 می‌باشند. مجموعه قند و باز آلی که از طریق پیوند بتا N- گلیکوزیدی به هم متصل هستند، نوکلئوزید را تشکیل می
دهند. اضافه شدن گروه فسفات به آنها، نوکلئوتید را تشکیل میدهد. گروه فسفات می‌تواند به کربن 3 و یا 5 متصل شود. پس دو نوکلئوتید از طریق یک پیوند فسفودی استر به هم متصل می‌شوند، به این صورت که گروه هیدروکسیل یک نوکلئوتید با گروه فسفات نوکلئوتید دیگر واکنش داده و پیوند فسفودی استر را به وجود می‌آورد. از آنجایی که پیوند فسفودی استر، کربنهای 3 و 5 دو قند مجاور را به هم متصل می‌کند، این پیوند را پیوند 3،5- فسفو دی استر نیز می‌نامند.
بین تیمین و آدنین، دو پیوند هیدروژنی و بین گوانین و سیتوزین سه پیوند هیدروژنی وجود دارد و براساس قانون شارگاف42، تعداد بازهای تیمین با آدنین و گوانین با سیتوزین برابر است، اما همیشه این قانون صادق نیست. بر طبق مدل واتسون- کریک، DNA یک زنجیره نوکلئیک اسید در اثر اتصال پشت سر هم، تعدادی۲-دزوکسی ریبونوکلئوتید به وسیله پیوندهای قند- فسفات تشکیل می‌شود. تمامی نوکلئوتیدها در یک زنجیره پلی نوکلئوتیدی دارای جهت یکسان می‌باشند، بهاین صورت که نوکلئوتید انتهایی در یک سمت زنجیره دارای یک گروه 5َ آزاد و نوکلئوتید انتهایی در سمت دیگر زنجیره دارای یک گروه 3َ آزاد می‌باشد. بنابراین زنجیره پلی‌نوکلئوتیدی دارای جهت بوده و این جهت را به صورت َ5 → 3َ نشان می‌دهند. بنابراین اگر در نوکلئوتید ابتدایی کربن َ۵ در بالای حلقه پنجتایی و کربن 3َ در زیر آن باشد، در تمامی نوکلئوتیدهای بعدی زنجیره کربن ۵َ در بالای حلقه پنجتایی جای خواهد داشت.
کشف ساختار مارپیچ دو رشته ای DNA، در سال ۱۹۵۳، بوسیله واتسون و کریک، واقعهای به یاد ماندنی در تاریخ علم بود [92]. بر طبق مدل واتسون-کریک، DNA دورشتهای مارپیچ است که در حالت طبیعی به شکل B-DNA و راستگرد میباشد. واتسون و کریک با استفاده از مطالعات تفرق اشعه ایکس رشته‌های DNA که به وسیله فرانکلین43 و ویلکینز44 تهیه شده بود و همچنین ساختن مدلها و استنباطهای مشخصی، مدل فضایی خود را ارائه دادند و در سال ۱۹۶۲، واتسون، کریک و ویلکینز به خاطر اهمیت کشف ساختمان DNA ، بهصورت مشترک جایزه نوبل دریافت کردند. مدل پیشنهادی آنان چنین بود که DNA یک مارپیچ دو رشته‌ای است که رشته‌های آن به دور یک محور مرکزی، معمولا بهصورت راست گرد پیچ میخورند. پیوندهای گلیکوزیدی بین بازها و قند در یک جفت باز مکمل که در مقابل هم قرار گرفتهاند در یک خط قرار نمیگیرند و در نتیجه دو شیار نامساوی در دو طرف ایجاد میشود که یکی بزرگتر از 180 درجه و دیگری کوچکتر از ١٨٠ درجه میباشد که به ترتیب شیار بزرگ45 و شیار کوچک46 نام دارند. طبق مدل واتسون و کریک، ستونهای قند- فسفات، همانند نرده‌های پلکان، به دو قسمت خارجی بازهای آلی پیچیده و به این ترتیب در معرض محیط آبی داخل سلول قرار میگیرند و بازهای آلی که خاصیت آب‌گریزی دارند، در داخل مارپیچ هستند [93]. هنگام تشکیل مارپیچ، رشته‌ها بهصورت موازی مقابل هم قرار می‌گیرند. یعنی اگر جهت یک رشته ۳←۵ باشد، رشته دیگر 5 ←۳ خواهد بود. گرچه از نظر اندازه، هر باز پورینی می‌تواند در مقابل یک باز پیریمیدین قرار بگیرد، ولی به دلیل وجود گروههای شیمیایی روی بازهای G ، C ، T و A، پیوندهای هیدروژنی مناسب فقط بین C با G و T با A برقرار می‌شود (شکل2-3). بنابراین اگر از هسته سلول شروع کنیم به کروموزومها وسپس به ژنها و در نهایت به مولکول DNA خواهیم رسید مولکول DNA، خود دو رشته است که توسط بازها به هم متصل است در واقع، مولکول DNA یک مولکول دو رشته
ای است که اسکلت سلولی آن را قند پنجتایی و گروه
های فسفات تشکیل میدهند. در واقع اتصال این بازها، منجر به اتصال دو رشتهیDNA به هم و پیچ خوردن آن میگردد.

مطلب مرتبط :   دانلود پایان نامه ارشد با موضوعتشویق و تنبیه، انگیزش کارکنان، نیروی انسانی، تحقیق و توسعه

شکل2-3- نموداری از یک کروموزوم و زنجیر دورشتهای DNA ی موجود در داخل کروموزوم و همچنین بازشده قسمتی از DNA با نشان دادن پیوند فسفودی استر بین دو قند پنج تایی و همچنین پیوند هیدروژنی بین بازهای آلی در ساختار دورشته‌ای) parsianshiraz.blogspot.com) DNA [94].
ساختار DNA میتواند اشکال سه بعدی مختلفی داشته باشد که شامل A-DNA، B-DNA و Z-DNA است، اگرچه فقط B-DNA و Z-DNA به صورت عملکردی در ارگانیسمها مشاهده میشوند [95]. شکل غالب DNA در محیط درون حیاتی47 را B-DNA یا DNA طبیعی مینامند. تنها از روی تفاوت قطر اشکال مختلفDNA نمیتوان به تفاوتهای آنها پیبرد، زیرا تفاوت اصلی به قطر و اندازه مربوط نیست، بلکه مربوط به این است که بخشهای درونی مارپیچ تا چه اندازه از سطح، قابل دسترسی هستند. همانطور که ذکر شد، DNA با توجه به توالی و شرایط محیطی، ساختارهای متنوعی به خود میگیرد (شکل 2-4)، در حالی که DNAهای با توالی تصادفی، معمولاً دارای شکلهای A، B و C هستند، اما الیگونوکلئوتیدها با توالیهای تکرار شونده، شکلهای D، E و Z (چپ گرد) را نیز میتوانند داشته باشند.

شکل2-4- ساختارهای متفاوت DNA [96].
علاوه بر توالی، عواملی مثل قدرت یونی، نوع حلال یا حضور بعضی کاتیونهای فلزی نیز بر اشکال مختلف DNA اثر دارد. شکل B سطح داخلی صافی ندارد، بلکه دارای دو شیار است که در سرتاسر طول DNA کشیده شده است. یکی از این شیارها عمیق و وسیع است و شیار بزرگ نامیده میشود. دیگری باریک و کم عمق که شیار کوچک نام دارد. A-DNA هم دو شیار دارد، اما شیار بزرگ آن عمیقتر و شیار کوچکتر آن کم عمقتر و وسیعتر از B-DNA است. Z-DNA از هر دوی آنها متفاوت است و تنها یک شیار عمیق و باریک دارد.
2-6-1- DNA سه رشتهای
سه رشتهای را بر حسب اینکه رشتهی سوم نسبت به رشتهی مشابهاش در DNA دو رشتهای، در چه جهتی قرار گرفته باشد به دو دستهی موازی همسو وموازی نا همسو تقسیم بندی میکنند [97]. پایداری سه رشتهای موازی ناهمسو بیشتر است. پس از تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین بازهای پورین و پیریمیدین بین دو رشته، اتمهایی بر روی این جفت بازها باقی میمانند که میتوانند در تشکیل پیوند هیدروژنی با باز سوم شرکت کنند. دو نوع ساختار DNA سه رشته ای وجود دارد: سه رشتهای درون مولکولی(H-DNA) که رشتهی سوم از داخل همان مولکول است که بیشتر در داخل سلول رخ میدهد و نوع دیگر سه رشتهای بین مولکولی که میان یک دورشتهای48 دارای قطعهی پورین پیریمیدین و یک الیگو نوکلئوتید اضافه شده، الیگونوکلئوتید تشکیل سهرشتهای49 (TFO) با توالی مکمل رشته پورین در شرایط آزمایشگاه ایجاد میشود [98]. نقش H-DNA در محیط درون حیاتی، کنترل بیان ژن ازطریق ممانعت از رونویسی میباشد. الیگونوکلئوتید ١٧ نوکلئوتیدی H-DNA، به نام TFO، پیشران برخی ژنها را قفل میکند و به این ترتیب از بیان آن جلوگیری میگردد. به همین دلیل TFO میتواند به عنوان داروی ژنی عمل کند. TFO میتواند به جایگاههای تنظیمی متصل شود و با عوامل رونویسی، در اتصال، رقابت کند. بنابراین، الیگونوکلئوتید تشکیل دهندهی سه رشتهایTFO ، اثراتی مثل توقف و یا مهار را در رونویسی دارد و همچنین میتواند تغییرات پایدار به ارث بردنی مثل ایجاد جهش و یا نوترکیبی را نیز در ژنوم، ایجاد کند. محققین امیدوارند که با این روش بتوانند از بیان برخی ژنها که در عوارضی همچون سرطان و برخی بیماریهای ژنتیکی نقش دارند، جلوگیری کنند. درواقع، ساختمان سهرشتهای قادر به تنظیم بیان ژن، تنظیم اتصال پروتئین، هدف یابی آسیب DNA میباشد. بنابراین، ابزاری را برای دستکاری جایگاه ژنی خاص، فراهم میکند [99].
2-6-2- DNA چهار رشتهای
DNA چهار رشتهای: در بعضی از نواحی DNA که دارای توالیهای خاصی از نوکلئوتیدها هستند، ساختارهای غیر معمول، از جمله: ساختارهای ثانویهای، مثل: سه رشتهای، چهار رشتهای، خمیده و… تشکیل میگردد [100]. تشکیل این ساختارها، سبب ظرفیت بخشی بیشتر به اطلاعات DNA شده و حالات بیانی متفاوتی به آن میدهد، در نتیجه تنوع آن بیشتر میگردد. ساختارهای 4 رشتهای شامل دو گروه عمده هستند: G-DNA و i-DNA
2-6-2-الف- G-DNA:
در توالیهای غنی از G، چهار G در کنار هم قرار گرفته و از طریق پیوند هیدروژنی به شکل با ساختار 4 رشتهای در میآید. در واقع، این چهار G به عنوان دهنده و گیرندهی پیوند هاگستین عمل می
کنند و یک حلقهی بسته را میسازند. Gها دارای دو حلقه هستند و دو حالت سین50 و آنتی51 دارند. در رشتههای غیر موازی، در یک رشته به صورت سین و در رشتهی دیگر به صورت آنتی هستند. این ساختار 4 رشته توسط کاتیونهایی، نظیر: سدیم و پتاسیم پایدار میشوند [101].

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه ارشد درموردریخت شناسی

شکل2-5- ساختار چهار رشتهای G-quderplux [102].
2-6-2- ب- i-motif :
اگر دو زنجیر DNA غنی از باز سیتوزین در مقابل هم قرار بگیرند، ساختمان چهار رشتهای i-motif DNA تشکیل میشود. تشکیل این ساختار به این صورت است تا دو رشته موازی غنی از C به صورت ناهمسو در یکدیگر درج شده52 یا در هم جای میگیرند و در قسمت میانی آن، تشکیل جفت باز +C-C صورت گرفته و اتصالات کامل میگردد. در نهایت به دلیل ناهمسو درج شدن دو تا دورشته در همدیگر، جفت باز +C-C بیرونی در یک دورشته، در انتهای ‘5 و در دورشته دیگر، در انتهای ‘3 قرار میگیرد و شیار بزرگ پهن و باز میشود و مرکز مولکول نیز از باقیماندهی ریشههای C که در هم درج شده اند، جفت می‌گردد و چون این دو تا دورشته در هم درج میشوند، به آن، motif در هم درج شدهی سیتوزین53 یا همان i-motif میگویند (شکل2-6).
شکل2-6- ساختار چهار رشتهای i-motif DNA-[103]
۲- 7- کاوشگرهای DNA و تثبیت آنها بر سطح مبدل:
معمولترین کاوشگرهای استفاده شده در زیستحسگرهای DNA، DNAی تک رشتهای و الیگونوکلئوتیدها هستند. پپتید نوکلئیک اسید54 (PNA)، هم به عنوان کاوشگر کاربرد دارد [104]. یک مرحله بسیار مهم در طراحی یک زیستحسگر الکتروشیمیایی DNA، تثبیت کاوشگر در سطح الکترود میباشد، زیرا تثبیت کاوشگر، در ویژگی کاوشگر و نیز پاسخ و کارائی یک زیستحسگر الکتروشیمیایی DNA تاثیر دارد [105]. روشهای تثبیت به نوع سطح الکترود و کاربرد زیست حسگر بستگی دارد. از جمله روش های تثبیت، می
توان به اتصال کووالانسی به سطح عاملدار، جذب سطحی، روش تک لایه خود انباشته و جا دادن در سل-
ژل55 یا پیکره پلیمری اشاره کرد [106].

2- 7-1- تثبیت DNAی کاوشگر از طریق جذب سطحی
سادهترین روش تثبیت کاوشگر بر سطح الکترودها، تثبیت از طریق جذب سطحی است. دستیابی به حساسیت و انتخابگری بالا به ترتیب به حداکثر رساندن کارایی دورگهسازی و به حداقل رساندن میزان جذب سطحی غیر اختصاصی نیازمند میباشد [107].
2-7-1-1- جذب سطحی فیزیکی
یک روش ساده برای تثبیت DNA در سطح الکترود کربن شیشهای این است که الکترود را در محلول حاوی کاوشگر غوطهور میسازند. پس از آن، به الکترود اجازه میدهند تا خشک شود [108]. شیوه دیگر برای جذب سطحی بر روی الکترودهای کربنی، قطرهگذاری است. یعنی قطره کوچکی از محلول کاوشگر را بر سطح الکترود گذاشته و با تبخیر حلال، خشک میکنند [109].

۲- 7-1-2- جذب سطحی در پتانسیل کنترل شده
این روش، سادهترین روش تثبیت کاوشگر بر روی الکترودهای کربنی پیشتیمار56 شده است. به منظور افزایش انباشتگی جذب سطحی کاوشگر، پیشتیمار اکسایشی سطوح کربنی الزامی است. تثبیت کاوشگر با اعمال پتانسیل در بسیاری از الکترودهای کربنی گزارش شده است. در این روش، ابتدا سطح هموار کربن با اعمال پتانسیل مناسب به سطح الکترود در طی زمان مناسب، پیشتیمار الکتروشیمیایی میشود که سبب افزایش ناهمواری و آبدوستی سطح کربنی میشود [110]. سپس جذب سطحی الکتروشیمیایی کاوشگر توسط محلول در حال به هم زدن، با اعمال پتانسیل مناسب در زمان معین انجام میشود. اعمال این پتانسیل سبب افزایش پایداری کاوشگر تثبیت شده از طریق برهمکنش الکتروستاتیکی بین سطح الکترود خمیر کربن به طور مثبت باردار شده و پیکرهی منفی فسفات DNA کاوشگر میشود.

۲-7-1-3- تثبیت DNA بوسیله اتصال کووالانسی
سینتیک دورگهسازی DNA به طور مستقیم به در دسترس بودن کاوشگر بر سطح الکترود بستگی دارد. پس مطلوب است که کاوشگر از یک انتهای خود به سطح الکترود با استفاده از پیوند کووالانسی متصل شود. این کار، فرایند دورگهسازی را بدون کنده شدن از سطح الکترود افزایش میدهد. همچنین انعطاف پذیری مولکول که باعث تغییر صورتبندی57 میشود، حفظ میگردد [111].

2-8- انواع برهمکنش میان نشانگرها و DNA:
مولکول DNAاز سه طریق مختلف قادر است با مولکولهای کوچک و لیگاندها یا داروها برهمکنش دهد [112]:
2-8-1- برهمکنش الکترواستاتیک:
مولکول DNAیک مولکول پلی الکترولیت باردار است، از آنجا که گروههای فسفات


دیدگاهتان را بنویسید