دانلود پایان نامه

TGFβ2، TGFβ3 که اغلب به‌خوبی موردمطالعه قرارگرفته‌اند TGFβ1 عامل کلیدی در بهبود زخم محسوب می‌شود. فرضیات زیادی درباره اتفاقات سلولی و مولکولی ترمیم زخم زده‌ شده است که یکی از این فرضیات پیشرو up regulation TGFβ1 است که باعث تکثیر سلولی و سنتز ماتریکس خارج سلولی می‌شود. اعضای خانواده TGFβ توسط رسپتورهای سرین- ترئونینی اختصاصی خودشان باعث شروع مسیر سیگنالینگ smad می‌شوند. فسفوریلاسیون باقی‌مانده سرینی باعث فعال شدن رسپتور می‌شود، که این فعال شدن باعث تعامل TGFβ با مولکول‌های پایین‌دست مؤثر، از جمله اعضای خانواده smad است.
۸ عضو خانواده smad تاکنون شناسایی شده است و به ۳ گروه تقسیم می‌شوند:
R smad: این عضو بسترهای مستقیم کینازی گیرندهی خانواده TGFβ هستند ازجمله smad ۱,۲,۳,۵,۸
Co smad: این عضو مرتبط با R smad هستند و نقش کمکی در طول سیگنالیگ دارند از جمله smad 4
Smad i: smads مهاری که علیه عملکردهای smads گروه پیشین نقش مهاری در سیگنالینگ دارند، و همچنین در رابطه با مشارکت TGFβ با smad ها و تأثیرشان بر روی پاتوژنز کلوئیدی در محل التیام زخم نقش بسزایی دارند، از جمله smad6,7 .
همچنین گزارش‌شده که در کلوئید فیبروبلاستی34 محل التیام زخم بیان TGFR2,TGFR1, در سطوح بالاتری نسبت به تکثیر عادی فیبروبلاست پوستی است. که افزایش رونویسی TGFβ و جفت شدنش با رسپتورهای اختصاصی‌شان باعث افزایش بیش‌ازحد فعالیت مسیر smadمی‌شود. نتایج مطالعات هالوگاوا همکارانش عملکرد TGFβ1 در پروسه بهبود زخم در in vitro و in vivo را نشان داده است. مهار مسیر Up regulation of TGFβ روشی مؤثر بر جلوگیری از تکثیر بیش‌ازحد تکثیر سلولی است. زمانی که سطح TGFβ1 مقدارش در سلول بالا برود با ایجاد کمپلکس با رسپتورهای اختصاصی‌اش باعث به راه افتادن مسیر سیگنالینگ می‌شود، که در نتیجه منجر به فسفریله شدن smad2,3 می‌شود و مقدار Psmad 2,3 در سلول بالا می‌رود و این smad2,3 با smad4، hetromerize می‌شود. با فعال شدن smad2/3 و اتصال به smad4 ایجاد یک کمپلکس می‌کنند و باهم به سمت هسته می‌روند، در هسته بااتصال به پروموترهای مورد هدفشان باعث تنظیم یکسری از ژن‌ها در سطح رونویسی می‌شوند در واقع این smads به‌عنوان Transcription factor در سلول فعالیت می‌کنند.(۵۲) در شکل (۱-۶) ارتباط مسیر سیگنالینگ smad 2/3 با فرایند ترمیم زخم نشان داده‌ شده است.
این ژن‌ها از جمله C-Myc، p21، p15، EMT، PAL-1،Collagen type1 ، cyklin dو غیره می‌باشند که هر کدام هدفی برای سلول دنبال می‌کنند این ژن‌ها باعث تکثیر و مهاجرت سلولی و آپپتوزیز و … می‌شوند.(۵۳) علاوه بر این ژن‌ها کمپلکس تشکیل‌دهنده p-smad4/p-2 smad3/psmad اثر خودتنظیمی بر روی ژن‌های smad3- smad2 نیز دارد.که باعث تقویت مسیر در آبشار سیگنالینگ بعدی می‌شود.
به‌طورکلی TGFβ عضوی از خانواده فاکتورهای رشد است، مسئولیت‌های درون‌سلولی زیادی دارد که یکی از آن‌ها پاسخگویی به بهبود زخم است. هر ۳ ایزو فرم مذکور در پاسخگویی این امر دخیل هستند. این ایزو فرم‌ها در زخم‌های جنینی ازلحاظ سطح بیان و مدت استفاده در ترمیم متفاوت‌اند اما در فعالیت‌های بیولوژیکی شباهت‌های زیادی دارند. فاکتور رشد TGFβ در تعدادی از پروسه‌های ترمیم زخم از قبیل التهاب، تحریک‌کنندگی، رگ زایی، تکثیر فیبروبلاستی، سنتز کلاژن و بازسازی ماتریکس خارج سلولی جدید دخیل است. بنابراین این فاکتور ازجمله فاکتورهای رشد مهم در فرایند ترمیم زخم محسوب می‌شود.(۵۴)، (۵۵)

شکل 1- 4: ارتباط مسیر سیگنالینگ smad2/3 با فرایند ترمیم زخم

۱-۲۳ اهداف طرح:
اثر فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر تکثیر فیبروبلاست
اثر فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف‌بر فعال شدن مسیر سیگنالینگ smad

فصل دوم
مواد و روش‌ها

۲-۱ مواد، وسایل و دستگاه‌های موردنیاز برای آزمایش‌ها به شرح زیر است:
جدول 2- 1: تجهیزات مورداستفاده
ردیف
نام تجهیزات و وسایل مصرفی
شرکت سازنده
کشور سازنده
۱
سانتریفیوژ
Hettich
آلمان
۲
بن ماری
Memmert
ایران
۳
ترازو با حداقل مقیاس
Sartorius
آلمان
۴
انکوباتور کشت سلولی
Labotect-c۲۰۰
ژاپن
۵
هود بیولوژیک ۲ class
Jahl
ایران
۶
میکروسکوپ معکوس
Oplympus
ژاپن
۷
یخچال ۴ درجۀ سانتی‌گراد
Siemens
آلمان
۸
فریزر ۲۰- درجۀ سانتی‌گراد
Siemens
آلمان
۹
فریزر ۷۰- درجۀ سانتی‌گراد
Angleantoipolar
ایتالیا
۱۰
تانک نیتروژن
MVE
آلمان
۱۱
لام مخصوص شمارش سلول نئوبار
HBG
آلمان
۱۲
پیپتور
Boeco
آلمان
۱۳
کیسه انتقالی جمع‌آوری خون محیطی با حجم mL ۵۰±۴۵۰
بعثت
ایران
۱۴
هود شیمیایی
کیمیا سکوداران
ایران
۱۵
میکروسانتریفیوژ
Sigma
آمریکا
۱۶
اسپکتروفتومتر
WPA
انگلستان
۱۷
دستگاه PCR(Thermal Cycler)
Eppendorf
آلمان
۱۸
دستگاه Real Time PCR
RG-6000(Corbett)
استرالیا
۱۹
پیپت ۵، ۱۰ و ۲۵ میلی‌لیتری
TPP
سوئد
۲۰
سمپلر ۱۰، ۱۱۰۰ میکرو لیتر
Ependorf
آلمان
۲۱
سر سمپلر ۱۰، ۱۱۰۰ میکرو لیتر
Biohit
ایتالیا
۲۲
لولۀ ۱۵ میلی‌لیتری
Falcon
آمریکا
۲۳
لولۀ ۵۰ میلی‌لیتری
Falcon
آمریکا
۲۴
فلاسک T-۲۵
Falcon
آمریکا
۲۵
فلاسک T-۷۵
Falcon
آمریکا
۲۶
ظرف کشت ۴ خانه‌ای
Falcon
آمریکا
۲۷
ظرف کشت ۶ خانه‌ای
Falcon
آمریکا
۲۸
ظرف کشت ۹۶ خانه
Falcon
امریکا
۲۹
فیلتر دارای منافذ ۸ میکرومتری
Millipore
آمریکا
۳۰
اسپکتروفتومتر
WPA
انگلستان
۳۱
مایکرویو
National

۳۲
تانک الکتروفور
Paya Pajohesh
ایران
۳۳
UV DOC
UVidoc

۳۴
گیره کیسه خون
بعثت
ایران
۳۵
Plasma extractor
دانش پژوهش فجر
ایران
۳۶
Shaker کیسه خون
دانش پژوهش فجر
ایران
۳۷
شمارشگر خودکار خون‌شناسی
Sysmex
آمریکا
۳۸
دستکش پلاستیکی و لاتکس
High-max
مالزی

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه درموردکودکان و نوجوانان، کودکان و نوجوان، آموزش کارکنان، ابزار ارتباط

جدول 2- 2: مواد مصرفی جهت آزمایشات سلولی
ردیف
نام ماده
شماره کاتالوگ
شرکت سازنده
۱
MEMPowder D
۱۲۸۰۰-۱۱۶
GIBCO
۲
L-Glutamine
۲۵۰۳۰-۸۱
GIBCO
۳
NaHCO3
S-۵۷۶۱
SIGMA
۴
HCL
H۱۷۵۸
SIGMA
۵
Penicillin/streptomycin
۱۵۰۷۰-۶۳
GIBCO
۶
MEM NEAA
۱۱۱۴۰-۳۵
GIBCO
۷
Fetal Bovine Serum
۱۰۲۷۰-۱۶
GIBCO
۸
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)
۲۱۶۰۰-۱۰
GIBCO
۹
Trypsin-EDTA
۱۵۴۰۰-۵۴
GIBCO
۱۰
Trypan blue
T۸۱۵۴
SIGMA
۱۱
Dimethylsulfoxide (DMSO)
D۲۶۵۰
SIGMA
۱۲
EDTA
ED4SS-500G
SIGMA
۱۳
Paraformaldehyde
P۶۱۴۸
SIGMA

جدول 2- 3: مواد و وسایل مورد نیاز برای بررسی بیان ژن
ردیف
Trizol
۱۵۵۹۶۰۱۸
Ambion
۱
cDNA Sinthesis Kit
K۱۶۳۲
Fermentase
۲
SYBR Green Ι detection
RR81W
TAKARA
۳
Agarose
A16900G
SIGMA
۴
۶X Loading Dye
R۶۳۱
Fermentas
۵
۱ Kb DNA Ladder
SM۱۱۳۳
Fermentas
۶
Ethidium bromide
۱۵۵۸۵-۱۱
Invitrogen

جدول 2- 4: مواد و وسایل موردنیاز برای تکنیک وسترن بلات
SDS for electrophoresis
L۴۳۹۰
Sigma
Temed
۸۷۶۸۹
Sigma
Tween20 for electrophoresis
P۵۹۲۷
Sigma
Amersham hyperfilm
۲۸۹۰۶۸۳۵
Ge
Microplate 96 well
۷۸۱۶۱۴
Brand
Aluminum sulfate
۲۲۷۶۱۷
Sigma
Methanol ACS grade
۱۰۶۰۰۹۵۰۰۰
Merck
Kodak GBX developer
P۷۰۴۲
Sigma-aldrich
Kodak GBX Fixer
P۷۱۶۷
Sigma-aldrich
XP western marker
LC۵۶۰
Invitrogen
Blot paper gb5
۱۰۴۲۶۹۸۱
Whatman
ECL advance WB
rpn۲۱۳۵
Ge
Blocking agent
rpn۴۱۸
Ge
XKRY antibody
L۱۹۰۸
SantaCruz
Anti Rabbit IgG
A۵۴۵
Sigma
PVDF membrane
۱۶۲۰۱۷۶
Biorad
Beta mercapto ethanol
M۶۲۵۰
Sigma
Anti bodi smad2
۲۴۴۵۶۱
Cell signaling
Anti bodi smad3
۲۳۵۱۶۸
Cell signaling
Anti bodi p-smad2
۱۲۶۷۸۹
Cell signaling
Anti bodi p- smad3
۱۳۵۶۷۸
Cell signaling

۲-۲ کشت و پاساژ رده سلول‌های فیبروبلاست انسانی
۲-۲-۱ رده سلولی موردمطالعه
در این مطالعه از سلول‌های فیبروبلاست بالغ انسانی استفاده گردید. سلول‌های ذکرشده از بانک سلولی پژوهشگاه رویان تهیه شدند.

۲-۲-۲ آماده‌سازی محیط کشت سلولی
در این مطالعه برای کشت سلول‌های موردنظر از محیط پایه35 DMEMاستفاده شد. به این محیط قبل از استفاده ۱۰% سرم جنین گاو36،۱% انتی بیوتیک پنی سیلین استرپتومایسین37،۱% گلوتامین38 و ۱% آمینواسیدهای غیرضروری39 افزوده شد. سپس به‌منظور حذف رشد انواع باکتری‌ها، محیط کشت ساخته‌شده توسط فیلتر ۲/۰ (که اجازه عبور ذرات بزرگ‌تر از ۰٫۲ میکرومتر را نمی‌دهد) فیلتر گردید. باید توجه شود که بعد از افزودن سرم محیط حداکثر باید به مدت دو هفته در دمای °C۴ نگه‌داری شود.

۲-۲-۳ پاساژ سلولی
در طی پاساژ سلول‌ها باهدف افزایش تعداد، از یک ظرف کشت به ظرف کشت دیگری منتقل می‌شوند. در شرایط آزمایشگاهی و هنگامی‌که شرایط رشد مناسب (دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد،
۵% CO2 در حضور محیط کشت مناسب و عدم حضور آلودگی) برای سلول‌ها فراهم باشد سلول‌ها در فلاسک تکثیر می‌شوند. هنگامی‌که تمامی سطح بستر توسط سلول‌ها پوشیده شود و یا تراکم سلولی بیش از ظرفیت گردد، سلول‌ها باید به ظروف دیگری انتقال داده شود. به این فرایند پاساژ سلولی گفته می‌شود. برای پاساژ سلولی ابتدا سلول‌ها با فسفات بافر سالین40 فاقد یون کلسیم و منیزیم به مدت ۳ دقیقه شستشو داده شدند.
به‌منظور جداسازی سلول از کف فلاسک به نسبت اندازه فلاسک ۱ تا ۴ میلی‌لیتر تریپسین اضافه شد، تریپسین اتصالات سلولی را می‌شکند و باعث جدا شدن سلول‌ها از کف فلاسک و شناور شدن آن‌ها می‌شود. سپس فلاسک حاوی سلول‌ها به مدت ۱ تا ۳ دقیقه در انکوباتور قرار داده شد و درنهایت با زدن ضربه تمام سلول‌ها از کف فلاسک جدا گردید. پس از جداسازی سلول‌ها از کف فلاسک به میزان سه برابر تریپسین استفاده‌شده، محیط حاوی سرم اضافه شد تا تریپسین غیرفعال گردد. محتویات حاوی فلاسک را به لوله‌آزمایش ۱۵ میلی‌لیتری منتقل شد. به‌منظور ته‌نشین شدن، سلول‌ها سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه، با دور ۱۵۰۰ و دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد سانتریفیوژ شدند.
بعد از اتمام سانتریفیوژ مایع رویی بیرون ریخته شده و رسوب سلولی در ۱ میلی‌لیتر محیط حل شد. پس از شمارش سلول‌ها تعداد موردنظر (حدود ۶۰۰۰۰۰ سلول برای فلاسک cm ۲ ۷۵ , ۲۰۰۰ سلول برای فلاسک cm ۲ ۲۵) به فلاسک افزوده و باقی سلول‌ها منجمد شدند.

مطلب مرتبط :   دانلود پایان نامه ارشد درموردمدل پیشنهادی، انعطاف پذیری، حالت طبیعی

۲-۲-۴ شمارش سلولی
به‌منظور شمارش سلولی از محیط همگن‌شده حاوی سلول، ۵ میکرو لیتر محیط برداشته و با ۵ میکرو لیتر تریپان بلو ۴/۰% که در فسفات بافر سالین فاقد یون حل‌شده است، مخلوط گردید. سپس با استفاده از لام نئوبار زیر میکروسکوپ نوری تعداد سلول‌های قرارگرفته در زیر هر ۴ مربع لام نئوبار شمرده‌شده و با استفاده از فرمول زیر تعداد سلول‌ها محاسبه گشت. در صورت زیاد بودن تعداد سلول‌ها برای شمارش راحت‌تر رقیق‌سازی صورت می‌گیرد. به این شکل که از مح
یط حاوی سلولی ۲۵ میکرو لیتر برداشته و توسط ۴۷۵ میکرو لیتر فسفات بافر فاقد یون ۲۰ برابر رقیق‌سازی انجام می‌شود.
با استفاده از فرمول زیر درصد سلول‌های زنده در نمونه سلولی تعیین شد:
(سلول‌های مرده، آن دسته از سلول‌هایی هستند که تریپان بلو در آن‌ها نفوذ کرده و به رنگ آبی درآمده‌اند.)
فرمول ۲-۱: زنده سلول‌های درصد=(ها سلول کل تعداد-مرده های سلول تعداد)/(سلول‌ها کل تعداد) × 100

فرمول ۲-۲:
= تعداد کل سلول ها ” تعداد کل سلول ها ” /”4″ ×2ضریب رقت (در صورت رقیق کردن سلول) ×حجم مایع لوله اصلی حاوی سلول104× ×درصد زنده بودن سلول ها

هرکدام از ۴ مربع لام نئوبار یک تکرار برای شمارش به‌حساب میآیند و به همین دلیل عدد نهایی بر ۴ تقسیم می‌گردد. همین‌طور استفاده از رنگ تریپان بلو موجب رقیق شدن نمونه سلولی گشته به همین دلیل عدد ۲ در فرمول قرار داده می‌شود.

۲-۲-۵ انجماد و ذخیره‌سازی سلول‌ها
به‌منظور انجماد سلول‌ها به ازای هر ۲۰۰۰۰۰۰ سلول ۱ میلی‌لیتر محیط انجماد41 اضافه گردید که این محلول شامل ۴۰% سرم جنین گاوی،۵۰% محیط پایه و ۱۰% دی متیل سولفوکساید42 است. دی متیل سولفوکساید حلالی قوی است که در فرایند انجماد سلولی در نقش یک محافظت‌کننده باعث جلوگیری از تشکیل بلورهای یخ و آسیب به سلول‌ها می‌گردد. سپس آن‌ها را به مدت ۲۴ ساعت در فریزر ۱۸- درجه سانتی‌گراد و سپس ۲۴ ساعت در فریزر-۷۰ درجه سانتی‌گراد نگه‌داشته شدند و پس ‌از آن نمونه‌های موجود به تانک ازت انتقال داده شدند. این عمل به‌گونه‌ای باید انجام گیرد که سلول‌ها کوتاه‌ترین زمان ممکن را در بیرون از فریزر بگذرانند زیرا افزایش دمای ویال باعث آسیب به سلول‌های موجود و کاهش درصد سلول‌های زنده می‌گردد. با انتقال به ازت مایع این سلول‌ها برای مدت طولانی قابل نگه‌داری است.

۲-۲-۶ ذوب کردن سلول‌های منجمد شده
جهت کشت مجدد (ذوب کردن) سلول‌های منجمد شده لوله کرایو ویال حاوی سلول منجمد از تانک نیتروژن به بن ماری ۳۷ درجه سانتی‌گراد منتقل می‌گردد به‌گونه‌ای که به‌اندازه یک ‌ذره‌ای کوچک از یخ در آن باقی بماند. در هنگام خارج کردن ویال رعایت احتیاط بسیار ضروری است زیرا در صورت بسته نشدن کامل در ویال ممکن است ازت مایع به درون ویال نفوذ کرده و در هنگام ذوب موجب انفجار شود. پس از ذوب شدن محتویات داخل کرایویال به یک فالکون انتقال داده شد و بر روی آن ۴ تا ۵ میلی‌لیتر محیط کشت افزوده شد.
براثر این کار دی متیل سولفوکساید رقیق‌شده و نمی‌تواند به سلول‌ها آسیب برساند. سپس به‌منظور ته‌نشین شدن سلول‌ها سانتریفیوژ به مدت ۵ دقیقه، دور ۱۵۰۰ و دمای ۲۵ درجه سانتی‌گراد انجام شد. پس از اتمام سانتریفیوژ محیط رویی را بیرون ریخته و آن را در ۱ میلی‌لیتر محیط حل کرده و به فلاسک حاوی محیط کشت تازه انتقال داده شد.
۲-۲-۷ تهیه فرآورده عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف
تهیه و آماده‌سازی عصاره پلاکتی از طریق پروتکل موجود در پژوهشگاه رویان انجام شد. برای این کار نمونه‌های خونی بند ناف به داخل کیسه‌های انتقالی (به حجمml 450+50) منتقل شد سپس کیسه انتقالی در g× ۳۰۰ و دمای اتاق به مدت ۲۲ دقیقه سانتریفیوژ شد. مایع زردرنگ بالایی (PRP) پلاسمای غنی از پلاکت43 نام دارد. PRP پلاسمای غنی از پلاکت با استفاده از plasma extractor به کیسه انتقالی دیگر وارد


دیدگاهتان را بنویسید