دانلود پایان نامه

و نیز خواندن فلورسنت تایید شده در پایان هر چرخه) تعداد چرخه ها 40 بار بود.

تست وسترن بلات
۲-۸ جمع‌آوری عصاره سلولی
به‌منظور مطالعات و بررسی‌های بیشتر، از عصاره سلولی در تست‌های وسترن بلات استفاده شد. برای جمع‌آوری عصاره سلولی، سلول‌ها در فلاسک ۷۵T کاشته شدند و پس از رسیدن سلول‌ها به حجم موردنظر فرآورده عصاره پلاکتی خون‌بند ناف با غلظت‌های متفاوت (%۸-۱۰%- UCB PL / FBS) به سلول‌ها اضافه گشتند. همچنین گروه کنترل مثبت محیط بدون,UCB PL و حاوی (FBS 10%) و گروه کنترل منفی بدون FBS و UCB PL ریخته شد.
سلول‌ها به ۵ دسته ذکرشده تقسیم شدند.
پس از ۲۴ ساعت محیط کشت را خارج کرده و سلول‌ها را با PBS شستشو دادیم. سپس ml ۱ از بافر لیز کننده تازه تهیه‌شده را به هر فلاسک اضافه کرده و عصاره سلولی حاصل را در فالکون ریخته و در C ْ ۲۰- نگهداری کردیم.

۲-۸-۱ تعیین غلظت پروتئین‌ها به روش بردفورد
برای تعیین غلظت پروتئین‌ها در نمونه‌های سلولی جمع‌آوری‌شده از تست بردفورد استفاده شد. بدین منظور ابتدا نمونه‌ها را به نسبت ۱ به ۱۰۰ با آب مقطر رقیق کردیم. از هر نمونه μl۲۵ به چاهک‌های پلیت ۹۶ خانه اضافه کردیم. برای رسم منحنی استاندارد از محلولBSA59 با غلظت‌های mg/ml ۱، ۵/۰، ۲۵/۰، ۱۲۵/۰، ۶۲/۰، ۳۱/۰، ۱۶/۰ و ۸/۰ استفاده کردیم. سپس به چاهک‌های حاوی نمونه، lμ ۲۰۰ معرف بردفورد اضافه کردیم. به‌عنوان بلانک از lμ ۲۵ آب مقطر به‌اضافه lμ ۲۰۰ معرف بردفورد استفاده شد. جذب رنگ آبی تولیدشده در طول‌موج nm۶۳۰ خوانده‌شده و منحنی استاندارد بر اساس جذب BSA رسم شد. معادله نمودار محاسبه‌شده و غلظت مجهول پروتئین‌ها در نمونه‌ها محاسبه گردید. برای محاسبه غلظت پروتئینی در نمونه‌ها، عدد به‌دست‌آمده در عکس رقت ضرب شده (۱۰۰×) و نتیجه به‌صورت mg/ml به دست آمد. سپس برای هم غلظت شدن تمامی نمونه‌ها، از روش رقیق‌سازی نمونه‌های غلیظ‌تر انجام شد.

۲-۸-۲ انجام تست وسترن بلات به‌منظور بررسی تغییرات سطح پروتئین‌های psmad2/3, smad2/3 در مسیر smad signaling
در تست وسترن بلات، ابتدا باید پروتئین‌های نمونه به‌صورت unfold درآیند تا بتوانند بر روی ژل SDS-PAGE (۱۲%) به‌خوبی حرکت کنند. بدین منظور از بافر نمونه استفاده‌شده و مخلوط نمونه و بافر نمونه به مدت ۵-۳ دقیقه در C ْ ۱۰۰ حرارت می‌بیند. نسبت بافر نمونه به نمونه باید ۱:۴ باشد.
در هر چاهک ژل، μl ۱۲ لود می‌شود بنابراین μl ۴/۲ از بافر نمونه و μl ۶/۹ از نمونه لازم مراحل انجام وسترن بلات به شرح زیر است:
مرحله SDS-PAGE:
در این مرحله ژل به‌صورت عمودی تهیه می‌شود و دارای ۲ قسمت است:
۱- Stacking ژل یا اصطلاحاً ژل بالا، که این ژل سرعت حرکت پروتئین‌ها را تنظیم می‌کند.
۲- separating ژل یا Running ژل یا ژل پایین که مسئول جداسازی پروتئین‌ها است.
غلظت آکریل آمید separating ژل بیشتر از Stacking ژل است.
ست وسترن دارای دو شیشه ضخیم و نازک است که ژل SDS-PAGE مابین این دو شیشه تشکیل می‌شود. ابتدا دو شیشه را کاملاً بر هم منطبق می‌کنیم و داخل کاست قرارمی دهیم و گیره‌های کاست را بسته و آن را روی پایه قرار می‌دهیم تا کاملاً فیکس شود. Stacking ژل را آماده کرده و در فاصلهی مابین دو شیشه ضخیم و نازک می‌ریزیم، به‌طوری‌که سطح آن از لبه شیشه cm۱ فاصله داشته باشد. مقداری ایزوپروپانول بر سطح ژل می‌ریزیم تا حباب را از ژل خارج کرده و سطح ژل را صاف کند. پس از ۷۵ دقیقه که separating ژل سفت شد، ایزوپروپانول را خارج کرده و Stacking ژل را بر روی separating ژل ریخته و شانه‌هایی را که چاهک‌های لود نمونه را ایجاد می‌کنند، بلافاصله درجای خود قرار می‌دهیم. پس از ۲۰ دقیقه Stacking ژل بسته‌شده و شانه‌ها را خارج می‌کنیم.

مطلب مرتبط :   پرایمر، توالی، سانتی، دمای

۲-۸-۳ مرحله الکتروفوز
ژل‌های SDS-PAGE آماده را وارد دستگاه الکتروفورز کرده و بافر الکترود را در فضای بین دو ژل و درون تانک الکتروفورز می‌ریزیم. سپس نمونه‌های سلولی آماده‌شده و مخلوط شده با بافر نمونه را توسط سرنگ همیلتون درون چاهک‌های Stacking ژل لود می‌کنیم.
در تست وسترن بلات، ابتدا باید پروتئین‌های نمونه به‌صورت unfold درآیند تا بتوانند بر روی ژل
SDS-PAGE (۱۲%) به‌خوبی حرکت کنند. بدین منظور از بافر نمونه استفاده‌شده و مخلوط نمونه و بافر نمونه به مدت ۵-۳ دقیقه در C ْ ۱۰۰ حرارت می‌بیند. نسبت بافر نمونه به نمونه باید ۱:۴ باشد. در هر چاهک ژل، μl ۱۲ لود می‌شود بنابراین μl ۴/۲ از بافر نمونه و μl ۶/۹ از نمونه لازم است. در چاهک ۱ μl ۲ از ladder و در چاهک‌های بعدی μl ۱۲ از نمونه‌ها را لود می‌کنیم. سپس الکترودها را در جای خود قرار داده و ولتاژ را روی V ۱۲۰ تنظیم می‌کنیم. هنگامی‌که تمام باندهای ladder از هم جدا شدند و خط نشانه تا پایین ژل آمد، جریان را قطع می‌کنیم.

۲-۸-۴ مرحله ساندویچ
این مرحله برای انتقال نمونه‌های پخش‌شده بر روی ژل به کاغذ PVDF است. ابتدا کاغذ PVDF را فعال کنیم. برای این کار کاغذ را به مدت ۱ دقیقه در متانول قرار می‌دهیم تا فعال شود. سپس کاغذ را ۲ بار با آب مقطر می‌شوییم. برای چیدن ساندویچ، بر روی سطح کاتدی به ترتیب پد60، کاغذ صافی، ژل، کاغذ PVDF، کاغذ صافی و پد را می‌چینیم. کاغذ صافی و پد باید قبل استفاده در بافر تانک وسترن گذاشته‌شده و هنگام استفاده کاملاً خیس باشند. ساندویچ را بسته و داخل دستگاه وسترن به مدت ۷۵ دقیقه در ولتاژ V ۱۲۰ گذاشته و اطراف تانک وسترن را از یخ می‌پوشانیم.

شکل 2- 8: مرحله تهیه ساندویچ

۲-۸-۵ مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌
ها:
کاغذ PVDF را که پروتئین‌ها بر روی آن منتقل‌شده‌اند، به مدت ۷۵ دقیقه در محلول Blocking بر روی شیکر قرار داده و پس‌ازاین مدت محلول Blocking را خارج کرده، آنتی‌بادی‌های اولیه smad2,smad3,psmad2,psmad3 را می‌افزاییم و ۱ شبانه‌روز61 بر روی شیکر C ْ ۴ می‌گذاریم. سپس با محلول TBST کاغذ را ۳ بار و هر بار به مدت ۱۵ دقیقه شستشو داده و پس‌ازآن کاغذ را درون آنتی‌بادی ثانویه به مدت ۷۵ دقیقه، در شیکر قرار می‌دهیم. پس از ۷۵ دقیقه، کاغذ را دوباره با TBST ۳ بار و هر بار به مدت ۱۵ دقیقه شستشو می‌دهیم و بعدازآن کاغذ را داخل سلفون قرار می‌دهیم.

مطلب مرتبط :   دانلود پایان نامه ارشد درموردمدل پیشنهادی، انعطاف پذیری، حالت طبیعی

شکل 2- 9: مرحله Blocking و افزودن آنتی‌بادی‌ها

از GAPDH به‌عنوان کنترل لود استفاده می‌شود زیرا این پروتئین دارای ژن House Kipping است و در بیان آن در تمام سلول یکسان است. از آنجایی‌که میزان لود تمامی نمونه‌ها باید برابر باشد، در صورتی ‌که خطایی در مرحله لود کردن یا حتی بردفورد باشد به‌وسیلهی باندهای GAPDH مشخص می‌شود.

۲-۸-۶ مرحله Stripping
این مرحله برای شستن آنتی‌بادی‌ها و کیت ECL از روی بلات و کاغذ PVDF استفاده می‌شود. برای این کار، بلات را به مدت ۵ دقیقه درون محلول Stripping بر روی شیکر قرار می‌دهیم و سپس این محلول را خارج کرده و ۲ بار به مدت ۱۰ دقیقه بلات را در محلول TBST شستشو می‌دهیم و از مرحله بلاکینگ ادامه می‌دهیم. این مرحله برای استفاده مجدد از بلات طراحی شده است.

۲-۸-۷ مرحله ظهور فیلم
برای شناسایی پروتئین‌ها و مشاهدهی تغییرات آن‌ها از کیت ECL استفاده می‌کنیم. این کیت دارای ۲ محلول A و B است که از هرکدام به میزان مساوی برداشته و با هم مخلوط کرده و بر روی کاغذ PVDF که درون سلفون قرارگرفته، می‌ریزیم و کاغذها را درون کاست گذاشته و در تاریک‌خانه فیلم را بر روی کاغذ قرار می‌دهیم. پس از گذشتن زمان لازم (بسته به نوع آنتی‌بادی)، فیلم را با استفاده از محلول ظهور و ثبوت ظاهر کرده و باندها را روی آن شناسایی می‌کنیم.
از برنامهی کامپیوتری Image.J به‌منظور آنالیز و دانسیتومتری62 عکس‌های وسترن بلات و باندهای پروتئینی استفاده می‌کنیم.

۲-۹ آنالیزهای آماری
آنالیزهای با استفاده از نرم افزار spss و تست پارامتریک ANOVA انجام شده است برای تعیین اینکه کجا اختلاف معنی داری بین گروههای تیمار شده با عصاره پلاکتی مشتق از خون بند ناف و گروههای کنترل در سلول های فیبروبلاست وجود دارد P≤0/05 به عنوان اختلاف معنی دار محاسبه شده است.

فصل سوم
نتایج

۳-۱ بررسی اثر غلظت‌های مختلف عصاره پلاکتی مشتق از خون‌بند ناف63 بر تکثیر سلول‌های فیبروبلاست


دیدگاهتان را بنویسید