دانلود پایان نامه

لوله آزمایش ریخته شد. نمونه های خون برای جلوگیری از منعقد شدن با بافر EDTA مخلوط گردید و تا زمان شروع استخراج در دمای 20- درجه سانتی گراد نگهداری شدند.

3-3-2- استخراج DNA ژنومیک
استخراج DNA، اولین و مهم ترین نیاز در اجرای تحلیل های ژنتیکی، مانند تشخیص جهش و پی بردن به توالی و عملکرد بخش ویژه ای از ژنوم است. موفقیت های ناشی از استخراج مناسب DNA به خلوص عالی و غلظت بالای DNA استخراج شده وابسته است. معمولاً کیفیت DNA با عواملی مانند عدم آلودگی ناشی از RNA، پروتئین، لیپید و سایر ساختارهایی که برای آنزیم Taq پلیمراز (Taq DNA Polymerase ) در واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) و آنزیم های برشی مزاحم، سنجیده می شوند] 6[.
مولکول هایDNA در مقایسه با توالی های پروتئینی، بسیار بزرگتر و پیچیده تر می باشند. هر یک از مولکول های DNA هسته ای اغلب حاوی صدها میلیون نوکلئوتید هستند. وقتی DNA با استفاده از روش های استاندارد از سلول ها جدا سازی می شود، مولکول های عظیم آن بر اثر نیروهای برشی قطعه قطعه و مخلوط های پیچیده ای از قطعات DNA بسیار بزرگ (به طول 50 تا 100کیلو باز) را ایجاد می کنند، که در این حالت چالش مورد مواجهه نحوه آنالیز آن است. در نتیجه با استفاده از روش اولترا سانتریفیوژ در گرادیان های چگالی تعادلی، معمولاً DNA به دست آمده از یک سلول به صورت یک نوار اصلی که نمایانگر توده DNA است، تفکیک می شود ]1.[
در این پژوهش استخراج DNA ژنومیک از طریق کیت استخراج DNA سیناژن (CinnaGen) ایران ، انجام پذیرفت.
3-3-2-1- استخراج DNA با استفاده از کیت شرکت سیناژن
مبنای کار استخراج DNA دو مرحله کلی دارد: 1- آزاد سازی DNA مورد بررسی از داخل سلول و لیز کردن آن توسط بافر لیز کننده. 2- حذف مواد آلی و تغلیظ DNA توسط بافرهای موجود در کیت. اما تفاوت های کوچکی در به کارگیری مواد و مقدار آن ها در مقایسه با کیت سینا ژن وجود دارد. با استفاده از این روش، DNA طبق دستورالعمل شرکت سازنده کیت استخراج گردید. اطلاعات مربوط به کیت مذکور در جدول 3-1 به اندازه ی یک نمونه لیست شده است.

جدول 3-1- مواد لازم برای استخراج DNA توسط کیت سیناژن برای 1نمونه
مقدار موجود
نوع ماده
400 µl
محلول لیز یا هضم کننده (Lysis Buffer)
300 µl
محلول رسوب دهنده (Precipitation Buffer)
400 µl
بافر شستشو 1 (Wash Buffer I)
800 µl
بافر شستشو 2 (Wash Buffer II)
30µl
بافر شوینده و پاک کننده (Elution Buffer)

در این روش، مقدار 100 میکرولیتر از نمونه خون بیمار را به میکروتیوپ ها منتقل کرده و با 400 میکرولیتر از محلول بافر Lysis مخلوط و سپس به مدت 20 ثانیه با بالاترین سرعت vortex می شود، تا یک سوسپانسیون یکنواختی ایجاد گردد، پس از آن 300 میکرولیتر از بافر رسوب دهنده (Precipitation) را به محلول اضافه و مجددا به مدت 5 ثانیه با سرعت vortex نموده می شود.
در این مرحله، سلول های گلبول های خونی متلاشی شده و محلولی از تمام مواد آلی و معدنی گلبول های سفید و قرمز به دست می آید. سدیم دودسیل سولفات (SDS) موجود در بافر لیز کننده، باعث حل شدن لیپیدها شده و پروتئیناز K آن باعث شکستن پروتئین ها و هیستون ها می گردد. مجموعه عوامل فوق باعث پاره شدن غشا سلول و هسته گردیده و رشته های نهایی DNA آزاد می شوند.
محلول فوق را با سمپلر به میکروتیوپ جدیدی که همراه با تیوپ مخصوص (Collction Tubes) موجود در کیت می باشد منتقل کرده و در 13000 دور در دقیقه (rpm) به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می گردد و سپس Collction Tube که حاوی رسوب موادی غیر از DNA می باشد دور انداخته می شود و میکروتیوپ حاوی محلول به Collction Tube جدیدی انتقال داده می شود.
در این مرحله 400 میکرولیتر بافر شستشو شماره 1 را اضافه نموده و باrpm 13000 به مدت 1دقیقه سانتریفیوژ کرده و مجدداً رسوبات غیر از DNA دور ریخته می شود، این کار با بافر شستشوی شماره 2 ، دو مرتبه تکرار می گردد و در آخر پس از انتقال محلول حاوی DNA به Collction Tube جدید، 30 میکرولیتر بافر Elution را اضافه و در دمای 65 درجه سانتی گراد به مدت 3 تا 5 دقیقه در بن ماری انکوبه می گردد و سپس مجدداً محلول درrpm 13000 به مدت 1 دقیقه سانتریفیوژ می شود تا در نهایتDNA به صورت نوار یا توده سفید رنگی بدست آید. سپس نمونه های DNA برای نگهداری در مدت زمان طولانی تر به فریزر با دمای 20- درجه سانتی گراد منتقل می شود.

3-3-3- بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده
برای انجام یک PCR موفق، باید DNA استخراج شده خالص و به مقدار و غلظت معین باشد. در بررسی کیفیت DNA نیازمند 3 طول موج مختلف 230 ، 260 و 280 نانومتر می باشیم. برای بررسی حضور پپتید و عوامل دیگر از نسبت طول موج های 260 و 230 ، و برای تعیین خلوص DNA از طول موج های 260 و 280 استفاده می گردد. DNA ، در طول موج 260 نانومتر جذب بهتری دارد ]42[. در این پژوهش برای بررسی کیفیت و کمیت DNA استخراج شده، از روش Nanodrop استفاده گردیده است.

مطلب مرتبط :   مقاله رایگان با موضوعاختلالات اضطرابی، سلامت روان، دوران کودکی، افسردگی اساسی

3-3-3-1- تعیین غلظت DNA با روش Nanodrop
تعیین غلظت نمونه های DNA توسط UV اسپکتروفتومتر دو بیمی در طول موج های 260 و 280 نانومتر انجام می پذیرد. بدین صورت که با تقسیم طول موج 260 بر طول موج 280 ، طبق فرمول زیر محاسبه می گردد:
1OD = 50 µg/ml dsDNA
OD 260/280 ≥ 1.8

عدد به دست آمده باید بالاتر از 8/1 باشد. چنانچه این عدد پایین تر از این مقدار باشد نشان دهنده وجود ناخالصی های پروتئینی در نمونه می باشد ]29 و 42[.
بدین منظور ابتدا یک میکرولیتر نمونه DNA را در جایگاه قرارگیری DNA گذاشته و غلظت آن توسط دستگاه محاسبه و خوانده شد، این عدد همان طور که ذکر شد باید در بهترین حالت 8/1 باشد تا صحت کار تأیید گردد. برای مثا
ل OD یک نمونه از خون های استخراج شده حدود 86/1 می باشد و غلظت DNA محاسبه شده آن µg/ml93 به دست آمد که نشان دهنده عدم وجود ناخالصی می باشد.

3-3-4- واکنش زنجیره ای پلیمراز ( PCR )
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، یک روش تکثیر DNA در خارج از محیط زنده، نخستین بار در اواسط دهه 1980 گزارش گردید. PCR به دلیل ساده بودن، نوعی تکنیک رایج با گستره وسیعی از کاربردهای متفاوت محسوب می گردد که اساساً دارای 3 مزیت عمده: سرعت بالا، حساسیت زیاد و قدرت می باشد ]1[.
حساسیت این روش، تکثیر مقادیر جزیی از DNA هدف را میسر می سازد. قدرتمند بودن روش PCR نیز بدین معنی است که اغلب، تکثیر DNA موجود در سلول های به شدت تخریب شده در محیطی که جداسازی DNA از طریق روش های استاندارد را دشوار می سازد با استفاده از PCR امکان پذیر می باشد ]1[.
اساس روش PCR، شامل سنتز انواعی از توالی های الیگو نوکلئوتیدی است که به عنوان پرایمر جهت سنتز DNA جدید در توالی های هدف معین موجود در DNA آغازین عمل می کنند. یعنی تکثیر انتخابی توالی های هدف است. PCR، شامل مجموعه ای از چرخه های متشکل از سه واکنش متوالی بوده که در دماهای متفاوت انجام می پذیرد ]21[. مراحل پایه ای و تکراری PCR به ترتیب شامل موارد زیر می باشند :
1- واسرشت شدن ( Denaturation ) : مخلوط تا دمای 94 درجه سانتی گراد گرم می شود. در این دما پیوندهای هیدروژنی بین جفت نوکلئوتیدها که مولکول دو رشته ای DNA را بهم متصل نگه داشته، شکسته شده و در نتیجه مولکول واسرشته می گردد.
2- اتصال پرایمرها ( Annealing ) : در این مرحله دمای مخلوط تا دمای 56 -50 درجه سانتی گراد پایین می آید. در این مرحله امکان اتصال 2 رشته مولکول DNA بهم وجود دارد، اما به دلیل وجود تعداد زیادی از الیگونوکلئوتیدهایی با توالی کوتاه، به نام “پرایمر” امکان اتصال دو رشته DNAاغلب امکان پذیر نیست و پرایمرها از طریق رابطه مکملی به مکان های خاصی از DNA متصل می شوند.
3- تکثیر DNA جدید (or Extension Synthesis ): در مرحله سوم دما مجددا افزایش می یابد، البته تا 74 درجه سانتی گراد. این دما برای فعالیت تگ DNA پلیمرازهای (Taq DNA Polymerase) موجود در مخلوط مناسب می باشد، تا بتوانند به انتهای پرایمرها متصل و سنتز DNA جدید را از طریق ایجاد رابطه مکملی باDNA الگو آغاز نمایند.
در پایان این مرحله, 4 رشته DNA به دست می آید و مجددا دما به 94 درجه سانتی گراد افزایش می یابد و این مراحل همان طور که در شکل 3-1 نشان داده شده است به صورت تکراری ادامه دارد تا رشته های بیشتری سنتز و تولید شوند ]21[.

شکل3-1- مراحل PCR

3-3-4-1- طراحی پرایمر
پرایمرها کلید موفقیت یا عدم موفقیت در فرایند PCR هستند. اگر به درستی طراحی شوند، می توانند به موقعیت اختصاصی تعریف شده، متصل شوند و تولید DNA هدف را با صحت و دقت، امکان پذیر سازند. “پرایمر” یک رشته و توالی کوچکی از اسیدهای نوکلئیک است که به عنوان آغازگری برای سنتزDNA طراحی می گردد. از آنجایی که DNA دو رشته ای است دو پرایمر نیاز است که در دو انتهای ژن هدف قرار گرفته شود و از ناحیه ‘ 3 آن تکثیر DNAآغاز می گردد (شکل 3-2). یک پرایمر باید با رشته الگوی خود در محل اتصال، مکمل باشد تا طبق رابطه مکملی بازهای آلی، هیبریداسیون اتفاق بیافتد، به طوری که انتهای ‘3 پرایمرها، به طرف یکدیگر قرارگیرند.

شکل 3-2- یک جفت پرایمر طراحی شده در 2 انتهای ژن

اولین و مهم ترین نکته ای که در طراحی هر پرایمر باید بدان توجه داشت، اندازه ی قطعه پرایمر است. اگر قطعه طراحی شده خیلی کوچک باشد، اختصاصیت اتصال آن به DNA هدف کاهش می یابد و ممکن است به هرقسمتی که تقریباً مکمل باشد متصل شود و اگر بیش از حد بزرگ باشد سرعت PCR را کاهش می دهد. از آنجایی که کارایی فرایند PCR با توجه به تعداد تکثیرهایی که در زمان تعیین شده تولید می کند، محاسبه می گردد، پس قطعه طویل پرایمر این سرعت را کاهش و کارایی PCR را پایین می آورد. بنابراین بهترین اندازه برای پرایمر، 20 تا 30 نوکلئوتید می باشد ]21 و 22[.
در این مطالعه ابتدا توالی مربوط به ژن ADRβ2 از پایگاه اطلاعاتی NCBIN دریافت شد. پرایمرهای ژن مربوطه که تنها حاوی 1 اگزون می باشد با استفاده از نرم افزار PrePrimer و Primer3 طراحی شد که حاوی 19 نوکلئوتید است. این نرم افزارها پرایمر را از نظر تشکیل پرایمر- دایمر یا خود مکملی بررسی کرده و مناسب ترین توالی را در اختیار کاربر قرار می دهد. سپس پرایمرها توسط شرکت “دانا ژن پژوه” ساخته شد. پرایمرهای استفاده شده در جدول زیر آورده شده است.
جدول 3-2- توالی پرایمرهای مورد استفاده برای PCR
نام اگزون
اندازه قطعه
نوع پرایمر
توالی پرایمر ( ‘3 ‹— ‘5 )
E1
759 bp
Forward
AAGCGGCTTCTTCAGAGCA

مطلب مرتبط :   منبع پایان نامه درموردکودکان و نوجوانان، کودکان و نوجوان، آموزش کارکنان، ابزار ارتباط

Reverse
GATGGCTTCCTGGTGGGTG

3-3-4-2- نحوه انجام PCR
در این پژوهش، برای تکثیر نواحی مورد نظر، واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) با استفاده از دستگاه PalmCycler CORBETT (ساخت کشور استرالیا)، در حجم µl 25 انجام گرفت. مخلوط واکنش شامل : µl 14 آب دوبار تقطیر، µl 1 پرایمر R (Reverse) ، µl1 پرایمر F (Forward)، µl2 نمونه DNA استخراج شده از خون بیمار و µl 7 مسترمیکس (حاویDNA پلیمراز و دئوکسی نوکلئوتیدهای لازم برای سنتز DNA) (شکل3-3).
ویال مستر میکس (Master Mix) تهیه شده از شرکت “بیوتک پیشگام” حاوی مواد زیر می باشد:
1- Tris-HCL pH 8.5, (NH4)2SO4 , 3mM MgCl2 , 0.2% Tween 20
2- 0.4 mM dNTPs
3- 0.2 unit/ µl Ampiliqon Taq DNA Polymerase
4- Inert Red dye and Stabilizer

شکل 3-3- مواد موجود در میکروتیوپ PCR

پس از مخلوط کردن مواد فوق، میکروتیوپ حاوی مخلوط را داخل دستگاه PCR قرار داده و برنامه دمایی متن
اسب با کار تنظیم می گردد. برای یافتن دمای مورد نظر، گرادیان گرفته و دمای 61 درجه سانتی گراد انتخاب می شود، زیرا در این دما باند DNA خوب و اختصاصی مشاهده شد. برنامه دمایی تنظیم شده، در جدول 3-5 آورده شده است. مدت زمان انجام PCR در این پژوهش 1ساعت و 42 دقیقه می باشد.

جدول 3-3- برنامه دمایی دستگاه PCR
Extention
Anealing
Denaturation
Cycle
Segment


Min 5 / ˚95
1
1
Sec 30 / ˚72
Sec 30 / ˚61
Sec 30 / ˚95
34
2
Min 5 / ˚72


1
3

3-3-5- الکتروفورز محصولات PCR
یکی از ساده ترین روش های تأیید محصولات PCR، الکتروفورز می باشد. “الکتروفورز” (Electrophoresis) به حرکات ذرات، در یک محیط مایع یا نیمه جامد، تحت میدان الکتریکی گویند. به سبب این که ماکرو مولکول های زیستی مانند DNA و پروتئین ها، باردار هستند می‌توان با قرار دادن آن ها در یک میدان الکتریکی، آن ها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی به نام الکتروفورز استفاده می‌شود ]21[.
مطالعه الکتروفورز DNA در سال 1964، زمانی که 3 گروه از محققان حرکت در محلول آزاد را با استفاده از روش های محدود و مرزی اندازه گیری کردند، آغاز شد. آن ها دریافتند که حرکت برای مولکول های DNA بزرگتر از 400 جفت باز، مستقل از اندازه بود. در حدود همان زمان، با الهام گرفتن از روش جدایی پروتئین ها در ماتریکس ژل مصنوعی، محققان دیگر، شروع به استفاده از ماتریکس های مشابه برای جداسازی مولکول هایDNA و RNA براساس جرم مولکولی نمودند. ماتریکس جدایی شامل: پلی آکریل آمید، آگاروز، آگار و ترکیب ژل های آگاروز- آکریل آمید می باشد ]45[.
در الکتروفورز ژل، از یک محیط نیمه جامد به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی ‌آکریل آمید (PAGE) و الکتروفورز ژل آگاروز تقسیم می‌شود. مولکول هایDNA در یک میدان الکتریکی از سمت کاتد (منفی) به سمت آند (مثبت) حرکت می نمایند. قطعات بزرگتر، کندتر و قطعات کوچکتر، به سرعت حرکت می کنند. بنابراین در این ژل‌ها، مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند ]3 و 21[.

3-3-5-1- ژل آگاروز
ژل آگاروز، یک پلیمر متناوبی از ترکیبات “β-D گالاکتوز” و “انیدرو α- L گالاکتوز” می باشد. مولکول های آگاروز در حالت محلول، یک ساختار سیم پیچ تصادفی را در دماهای بالا ایجاد می کنند. پس از سرد شدن محلول، زنجیره های آگاروز دسته های فیبری مارپیچی را تشکیل می دهند که توسط پیوند های هیدروژنی به یکدیگر متصل شده اند ]45[.
برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگاروز استفاده می‌شود.


دیدگاهتان را بنویسید